PCR仪操作使用说明

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一、试剂PCR仪
1.引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。
2.耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。
3.10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。
4.5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度用UV吸收法测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。
5.DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。

二、操作程序PCR仪
过去标准的PCR操作程序是将PCR仪必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下：
1.向一微量离心管中依次加入
DNA模板             102-105拷贝
引物                各1μmol/L
dNTP                各200μmol/L
10×PCR缓冲液       1/10体积
ddH2O               补到终体积（终体积50μl-100μl）
混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。
2.加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。
3.冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。
4.PCR仪的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。较为后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
PCR仪尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。
在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。